Кератоконус, фотография American Optometric Association.

Обычно с такими заголовками люди рассказывают о своей болезни и как им удалось её преодолеть, но это несколько другая история. Учёному редко удаётся повлиять на глобальные события в мире. Как правило, исследовательская деятельность заканчивается на публикации результатов в научном журнале, иногда престижном, иногда не очень. На неё ссылаются другие статьи других учёных и всё это вместе на неощутимые микрометры двигает познание человечества о мире вперёд. Эксперименты, статьи в журналах, индексы цитирования, гранты, отчёты, вот в общем то и всё. Но иногда, очень редко, одно открытие действительно меняет всё. Десятилетия люди думали о синтетической роговице. Казалось бы, роговица — это же всего лишь коллагеновая линза, в ней нет сосудов. Наши технологии разработки гидрогелей и биоматериалов значительно продвинулись за последние десятилетия. Может можно создать нечто наподобие контактной линзы, которую можно просто пришить человеку вместо больной роговицы, и он будет видеть? Собственно, именно это в конечном счёте мы и сделали, только потребовалось 10 лет, десятки тысяч, человеко-часов работы, жизни сотен крыс, кроликов и свиней чтобы получить рабочую сборку, но обо всё по порядку.

Кератоконус – это патология роговицы, где коллагеновые волокна теряют свою устойчивость, центральная часть выпячивается наподобие конуса, отсюда и название. Роговица перестаёт выполнять свои оптические свойства формируя размытое изображение на сетчатке. На начальных этапах этот процесс поддаётся коррекции очками и контактными линзами, но со временем оптических возможностей стекла становится недостаточно. Почти все системы глаза функционируют нормально, но человек больше не видит предметов и может лишь отличить день от ночи. В терминальной стадии коллапс коллагеновых волокон становится катастрофическим, роговица больше не может контролировать водный баланс, набухает и становится окончательно непрозрачной. Встречается кератоконус у одного человек из 700, этакая лотерея правда главный приз так себе. Кератоконусом страдают около 1.1 миллиона пациентов в мире, если собрать их в одном месте, получится город вроде Челябинска или Самары, город слепых людей. К сожалению, большинство пациентов с кератоконусом теряют зрение гораздо раньше, чем болезнь переходит в тяжёлую стадию, так как жёсткие контактные линзы доставляют слишком большой дискомфорт при ношении, а мягкие контактные линзы на кератоконусе не держатся из-за аномальной топографии глаза. Представьте себе дилемму, терпеть чудовищную боль в глазах, но хоть что-то видеть или смириться с жизнью в мире размытых теней. Со временем почти каждый пациент выбирает второе, слишком тяжело носить жесткие линзы.

Топография роговицы и острота зрения у здорового глаза и при кератоконусе. Красным помечается истончение роговицы в центральной зоне. Внизу симуляция астигматизма при кератоконусе.

На самом деле не так много вариантов лечения кератоконуса.

1. Крослинкинг с витамином B2 ультрафиолетовым светом – Витамин B2, он же рибофлавин очень интересное вещество, под воздействием мягкого ультрафиолета-А он может связываться с коллагеновыми волокнами увеличивая их прочность. После крослинкинга роговица укрепляется и процесс замедляется, но полностью остановить кератоконус таким образом нельзя.

2. Трансплантация роговицы – больную роговицу можно просто заменить, здоровая роговица будет иметь правильную форму и человек снова сможет видеть. Роговица наиболее успешно трансплантируемый орган. Казалось бы, почему вообще есть слепые люди с кератоконусом в таком случае? Пересадка роговицы требует развитой системы глазных банков, где процесс забора донорских глаз, тестирования гепатитов, ВИЧ и рядя других патогенов и немедленной пересадки отработан. Все это выливается в высокую стоимость процедуры и ограниченную доступность роговиц. К тому же они очень нужны для ряда других тяжёлых заболеваний как ожоги роговицы, дистрофия Фукса и многие другие заболевания требущих пересадки.

Иллюстрация процедуры кросслинкинга из материалов статьи Cross-linking of protein scaffolds for therapeutic applications: PCL nanofibers delivering riboflavin for protein cross-linking 10.1039/C3TB21789B

Виды пересадки роговицы PKP - Penetrating Keratoplasty, пересадка роговицы на всю толщину. И DALK - Deep Anterior Lamellar Keratoplasty частичная пересадка стромы роговицы с использованием лазера. Процедура DALK предпочтительней она сохраняет эндотелиальный фрагмент для ещё одной пересадки пациенту с дистрофией Фукса (если такой есть в наличии), так же процедура менее травматична, сохраняется оригинальный эндотелий и эпителий.

Синтетическая роговица должна обладать следующими свойствами.

1. Обладать высокими оптическими свойствами.
2. Не пропускать ультрафиолет, нейроны сетчатки очень его не любят, но хорошо пропускать видимый спектр.
3. Быть достаточно жёсткой для хирургического вмешательства, тончайшие полипропиленовые нити, которые используются в офтальмохирургии не должны её резать, но имплант не должен быть слишком жёстким чтобы не причинять дискомфорт и не получить отторжение. Кусок пластмассы пересадить не получится.
4. Материал должен быть совместим с клетками человеческого тела, он должен интегрироваться в живые ткани, при этом обладать достаточно жёсткой структурой, чтобы макрофаги не растащили его на сувениры.
5. По возможности синтетическая роговица должна быть сделана из дешёвого материала и подходить для массового производства и стерилизации.
6. Полученный продукт должен иметь возможность длительного хранения в том числе и при комнатной температуре.

Славный город Линкопинг.

Как видите в требованиях к материалу аналогу роговицы - сплошные противоречия. В 2015 году меня пригласили в Швецию попытаться решить эту не решаемую задачу. Деньги на это предоставляла компания LinkCare и несколько европейских грантов в том числе Европейским Arrest Blindness. Я слетал в Москву, получил Шведский вид на жительство, и полетел в славный город Ликопинг. Говорят, в Швеции довольно красиво, если честно, я страну так толком и не посмотрел, был в Стокгольме по делам несколько раз, не более того. По большей части следующие 2 года я практически не выходил из лаборатории, приспособился даже спать в офисе, да и вся наша научная команда практически жила там. Пять часов сна, кофе, таблетка кофеина чтобы разогреться с утра, сигарета или даже три и можно начинать. Как сказал классик "Распалась связь времён" день и ночь, дни, месяцы и годы слились в один размытый процесс, мир за пределами лаборатории стал казаться нереальным. Думаю мы вели не самый здоровый образ жизни.

Будни лаборатории, в кадре Мария Ксерорудаки за микроскопом, Энтони Муквая и ваш покорный слуга Доктор Ганнибал обсуждают эксперимент по очередной тестовой сборке на заднем плане.

Каждый в команде отвечал за выполнение одного или нескольких аспектов проекта. Я, в частности, тестировал сборки материала на крысах и кроликах и анализировал стабильность материала гистологическими исследованиями. Многие научные группы раньше пытались использовать разные материалы от гидрогелей, пластиков, до синтетического человеческого коллагена. Результаты в большинстве случаев получались чудовищные. Отторжение, распад материала, острый воспалительный процесс, потеря оптических свойств. Много несчастных кроликов с вытекшими глазами, очень недовольные сотрудники вивария.  После нескольких неудач мы сфокусировались на коллагене тип I (Collagen I), полученном из кожи свиней, он был дешёвым, линзы из него получались с отличными оптическими свойствами. Коллаген тип 1 и не вызывал отторжения, но не все гладко было с прочностью, пропусканием ультрафиолета и долговременной стабильностью мы называли материал BPC (Bioengineered Porcine Construct). Кролики получали роговицы, они около трех месяцев они функционировали нормально, дальше иммунная система начинала разбирать пересаженный материал, коллапс трансплантата и очередная неудача. Нужно было перерабатывать дизайн, возможно использовать другой коллаген, но мы уже были близко. Тогда мы вспомнили о крослинкинге с витамином B2, если крослинкинг у людей укрепляет роговицу, может он сможет помочь укрепить и биоматериал. Так же B2 поглощает ультрафиолет, и мы сможем решить проблему пропускания ультрафиолета синтетической роговицей.

Доктор Мутукумар Тангевелу до начала проекта и после его завершения.

Мой коллега Мутукумар заработал нервное и физическое истощение, но нашёл сборку, которая отвечала нужным свойствами. Особая программа двойного ультрафиолетового крослинкинга с витамином B2 и дальнейшая стерилизация ультрафиолетом-С. В электронном микроскопе материал выглядел очень хорошо, похоже на настоящую роговицу. Главное, поместив материл в спектрофотометр, мы увидели, что поглощение ультрафиолета в целом совпадает с человеческой роговицей B2 выполнил свою задачу. Механические свойства и устойчивость на разрыв тоже вырасли. Клетки роговичного эпителия человека росли на новом материале отлично, гораздо лучше, чем обычном пластике в культуре.

а. Внешний вид биоматериала BPCDX. b. Спектрофотометрия BPCDX в УФ и видимом спектре. с. Механические свойства биоматериала, он получился в три раза менее прочным чем человеческая роговица, но этого хватило. d. снимки структуры волокон свинной роговицы и сборки BPCDX биоматериала. e. Скорость разрушения биоматериала протеолитическими ферментами в сравнении с человеческой роговицей. f. Рост клеток роговичного эпителия человека на пластике (слева) и на BPCDX (справа).

Я подсадил материал крысам подкожно, посмотреть, как будет идти заживление ран и как материал себя поведёт в живом теле. Раны у крыс заживали хорошо, а главное, когда я извлёк материал месяц спустя не было ни воспаления, ни клеточной инфильтрации вокруг импланта. Совсем чуть чуть фиброза на границе с имплантом, но материал иплантировался подкожно на не в глаза, это было ожидаемо.

Теперь нужно было посмотреть, как материал поведёт себя в глазах, мы купили 10 мини свиней  и принялись за работу. 

Схема хирургической процедуры DALK-Flap у свиней. Фемтосекундным лазером, свиньям делался вырез роговицы в виде кармана, фрагмент роговицы удалялся и в этот карман мы помещали биоматериал. В качестве контроля мы использовали вырезанные фрагменты оригинальной роговицы и подсаживали их обратно, это называется аутотрансплантация.

Свиньи пожалуй лучшее животное для экспериментов на глазах, но большое, дорогое и шумное.

Дальше было очень много возни со свиньями они ведь только мини по сравнению с обычными, 30 килограммовые зверюги которым нужно было капать дексаметазоновые капли в глаза после операции, под дикие визги в экспериментальном хлеву.

а. Результаты оптической когерентной томографии и фотографии глаз 6 месяцев после пересадки. b. Пахиметрия (топография) роговицы после пересадки роговицы или материала BPCDX. c. Параметры тощины роговицы и частота осложенений после пересадки у мини-свиней. d. Конфокальная микроскопия слоев роговицы с автографтом или BPCDX.

Полгода спустя эксперимент подошёл к концу, к нашему восторгу биоматериал, который мы к тому времени назвали BPCDX (bioengineered porcine construct, double crosslinked) полностью интегрировался, даже лучше, чем при авто-трансплантате, родной кусок роговицы, который мы вырезали и сразу пересадили обратно для контрольной группы. Топография роговицы выровнялась, а самое главное вкруг биоматериала стали расти роговичные нервы и никакого воспаления или помутнения.

Интеграция биоматериала в окружающие ткани роговицы по результатам гематоксилин эозинового окрашивания. Бета-3-Тюбулин показывает рост нервов вокруг импланта.

Настало, временя испытать процедуру и биоматериал на слепых людях с кератоконусом. Это был очень длительный с точки официальных документов и очень напряжённый этап. Если мы где-то допустили ошибку, например, в том, что свиной коллаген хорошо приживался у свиней, но у людей может вызывать иммунный ответ, а протестировать снова уже не было времени и денег. Если я ошибся, десятки людей испытают чудовищные страдания и возможно потеряют то немногое, что них осталось от их глаз. Уверен ли я в своих результатах? Когда я подписывал документ “Свойства биосовместимости допустимы для человеческого применения”, я на самом деле вовсе не испытывал той уверенности, что показывал комиссии во время презентации.

Тестировать биоматериал мы решили на группе добровольцев из Ирана и Индии. Во-первых, из финансовых соображений, это было дешевле ресурсы выделенные на проект стали подходить к концу, во-вторых, в этих двух странах было достаточно полностью слепых пациентов с кератоконусом, и хирурги в двух центрах согласились участвовать в проекте. Мы немного беспокоились, что пациенты в Иране могут отказаться от трансплантации по религиозным соображениям, всё-таки биоматериал был сделан из свиного коллагена, но, проблем с этим не возникло, никто даже не задал о свином коллагене вопрос, наверное, когда ты едва можешь отличить день от ночи границы допустимого, сильно раздвигаются.

Внешний вид тестового продукта для клинических испытаний. Тестовая сборка BPCDX до начала массового производтсва. Кроме собственно кератоконуса BPCDX может быть использован как замена человеческой роговицы при множестве других патологий требующих пересадки.

Основные критерии для отбора для участия в клинических испытаний были следующие:

-Возраст совершеннолетия.
-Выраженный кератоконус
-Показания к пересадке роговицы.
-Способность понять объяснения и подписать официальные документы для участия.
-Отсутствие операций на глаза
-Отсутствие системных заболеваний

Операции прошли штатно, они сравнительно простые и мы давно всё отработали на свиньях. С каждой неделей я с ужасом ждал звонка или электронного письма, что импланты начали отторгаться. Мне снились выворачивающие душу кошмары в котором я был окружён людьми с вытекшими глазами они цепко хватали меня за руки и кричали на непонятном языке, но я понимал - "Это ты виноват!", с кофеином в таблетках нужно было завязывать. Но эти переживания были у меня в голове, в реальности, сразу после операции люди смогли видеть. Пусть им всё равно потребовались очки или контактные линзы, но они по крайней мере могли их теперь носить. В больницу привели 20 практически слепых людей, вышли уже зрячие пусть и на один глаз. Из соображений безопасности пациентов мы делали трансплантацию только на одном глазу. К 6 месяцам я наконец выдохнул, похоже трансплантаты были стабильны, оставалось только ждать. Дольше 6 месяцев мы на животных эксперименты не проводили и меня несколько беспокоил тот факт, что мы не знали как долго рибофлавин который держал коллагеновые волокна остаётся стабильным тем более в человеческом теле, проект шёл через неизведанные воды. Узнать, что происходит с пациентами больше не представлялось возможным, повторный осмотр была запланирован только через 1.5 года, так что отсутствие новостей было само по себе хорошей новостью.

Схема операции при испытании BPCDX у людей.

К концу первого года после пересадки я стал забывать о пациентах и проекте в целом сместив свои интересы в сторону нейробиологии, дегенерации сетчатки и болезни Альцгеймера. Наконец 24 месяца после пересадки пациенты вернулись в клинику, пришли своим ходом и без сопровождающих, большинство пациентов жили полноценной жизнью, смогли найти работу, многие просили нас провести пересадку на второй глаз, к сожалению, программа исследования этого не подразумевала и бюжет проекта был истощён. Результаты были отличными, BPCDX интегрировался в окружающие такни, роговичные нервы регенерировали эпителий и эндотелий роговицы функционировали штатно, а главное никакой резорбции и отторжения импланта.

Пахиметрия и оптическая когерентная томография у пациентов в Иране до и после хирургического вмешательства. В нижнем левом углу фотографии BPCDX в глазах у двух пациентов 6 месяцев после хирургического вмешательства. В нижнем правом углу результаты конфокальной микроскопии роговичных нервов и эндотелия после пересадки BPCDX.

Показатели у 12 пациентов с кератоконусом в Иране, до и после операции, обратите внимание на число полностью слепых, до операции 6 и после операции 0. А так же появившуюся строку зрение LogMAR lines gained.

а. Фотографии щелевой лампы, до и после операции. b. Оптическая когерентная томография роговицы до и после операции, довольно хорошо видно имплантированный биоматериал BPCDX в Индии была хороший OCT инструмент. c. Результаты топографии роговицы, хорошо видно улучшение толщины и более равномерная поверхность особенно в центральном регионе. 

Результаты у пациентов в индии, все 8 пациентов были полносью слепы на момент операции. И все вернули и сохранили зрение 2 года спустя. Как видите результаты из группы в Индии немного лучше чем в Иране. Одним из возможнных факторов чуть меньшая толщина BPCDX транспланта.

С тех пор как я ушёл из хирургии в науку, мне очень редко удаётся увидеть практические результаты своей работы, но это было особенное ощущение, все эти люди, мужчины и женщины уже второй год могут видеть благодаря нашей работе, это было очень необычное удивительное чувство. В ближайшие несколько лет, когда будут получены разрешающие документы биоматериал будет одобрен для массового клинического применения кератоконус больше не будет забирать у людей возможность видеть этот мир.

Слева направо: Энтони Муквая, Мария Ксерудаки, Доктор Ганнибал, Мирабелли Перфранческо, Нил Лагалли.

Ещё около года мы писали научную статью обрабатывали результаты и перепроверяли статистику, дальше статья ушла в Nature Biotechnology журнал с impact factor 68. Ревизии и проверка данных продолжалась ещё полтора года, журнал проверял и перепроверял каждый эксперимент и каждый результат. Наконец, 11 Августа 2022 года статью опубликовали.

Публикация Rafat, M., Jabbarvand, M., Sharma, N. et al. Bioengineered corneal tissue for minimally invasive vision restoration in advanced keratoconus in two clinical cohorts. Nat Biotechnol (2022).
Received: 28 April 2021, Accepted 29 June 2022; Published11 August 2022
DOI https://doi.org/10.1038/s41587-022-01408-w

Про нас довольно много пишут в новостях https://www.nature.com/articles/s41587-022-01408-w/metrics

Подводя итог, BPCDX сейчас проходит одобрение для массового применения в Евросоюзе и США уверен остальные страны поддтянутся за лицензиями на покупку и производство, надеюсь Россия не останется в стороне. Кератоконус перестал быть заболеванием угрожающим зрению. Следующие пять лет мы ождаем сотни тысяч имплантаций по всему миру. Комманда Нила Лагали vs Кератоконус 1:0.